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介紹                                                

通常從人體活檢中采集并保存福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本，用于組織學(xué)研究。福爾馬林固定法通過將核酸和蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)容物交聯(lián)并將樣品包裹在蠟中，使材料可在室溫下保存多年。世界各地的生物中心和研究人員儲(chǔ)存了數(shù)以百萬計(jì)的FFPE樣本。

隨著文庫(kù)準(zhǔn)備和下一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，這些樣本中保存的核酸現(xiàn)在可以被恢復(fù)，以產(chǎn)生重要的基因組信息。因此，存檔的FFPE樣品成為了豐富而珍貴的研究材料來源。越來越多的研究實(shí)驗(yàn)室利用zinq FFPE樣本來分析和了解與疾病相關(guān)的基因和突變多種因素導(dǎo)致了從FFPE分離出的DNA質(zhì)量的變化，包括保存過程中發(fā)生的核酸化學(xué)變化，保存過程缺乏標(biāo)準(zhǔn)化，以及存檔樣本的年齡。從FFPE樣本中分離出的DNA質(zhì)量較低，有望產(chǎn)生低復(fù)雜度的NGS文庫(kù)，因?yàn)楸M管分離出的DNA有明顯的濃度，但DNA的“可用”量很低為了創(chuàng)建具有大多樣性的庫(kù)，選擇正確的庫(kù)準(zhǔn)備方法是至關(guān)重要的。ThruPLEX technoloqy使用莖環(huán)適配器，這樣就不需要中間的清理步驟，維持單管工作流程，并保持庫(kù)的復(fù)雜性。后的擴(kuò)增利用了所有修復(fù)和連接的分子，結(jié)果在文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了大量的*分子(Fiqure 1)。另一個(gè)好處是，創(chuàng)建文庫(kù)的時(shí)間減少到大約兩小時(shí)。ThruPLEX DNA-seq庫(kù)也可以很容易地與其他應(yīng)用程序集成，如目標(biāo)富集。輸入材料的高度多樣性保證了捕獲將產(chǎn)生文庫(kù)的優(yōu)良覆蓋整個(gè)基因組的目標(biāo)區(qū)域

 Fiqure 1.采用ThruPLEX技術(shù)。這個(gè)工作流程使用了一個(gè)三步單管反應(yīng)，開始的片段雙鏈DNA，經(jīng)過一個(gè)高效的修復(fù)過程。接下來，莖環(huán)適配器被鈍端連接到修復(fù)的輸入DNA上。使用高保真聚合酶對(duì)這些分子進(jìn)行擴(kuò)展和擴(kuò)增，使其包括條形碼，從而生成索引化的Illumina NGS庫(kù)。

 在本技術(shù)說明中，我們演示了我們的通用文庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒——ThruPLEX DNA-seg試劑盒與ffpe衍生的DNA一起使用時(shí)的性能和特點(diǎn)。對(duì)于非FFPE樣本，標(biāo)準(zhǔn)方案建議的輸入范圍為0.05-50 ng，在此，我們將輸入量增加到100 ng，以補(bǔ)償FFPE樣本中受損的DNA。我們的結(jié)果表明，在Ilumina平臺(tái)上從ffpe提取的DNA中制備NGS文庫(kù)時(shí)，ThruPLEX DNA-seq技術(shù)是一個(gè)很好的選擇。與其他庫(kù)準(zhǔn)備工具包相比，它提供了更多樣化的庫(kù)，同時(shí)小化了GC偏差。我們進(jìn)一步演示了ThruPLEX DNA-Seq試劑盒如何與Agilent SureSelect富集試劑盒成功集成，對(duì)FFPE樣品進(jìn)行靶向測(cè)序。

 結(jié)果                                                

ThruPLEX DNA-seg技術(shù)生產(chǎn)的文庫(kù)比NEB Next Ultra或KAPA Hyper試劑盒更具多樣性。平均而言，ThruPLEX library產(chǎn)生的估算庫(kù)大小比NEB Next Ultra大80%，比KAPA Hyper大240%，表明ThruPLEX library中存在更多的*分子(圖2)。正如預(yù)期的那樣，ThruPLEX DNA-seq產(chǎn)生的重復(fù)讀取不到2%。與NEBNext Ultra相似，而KAPA Hyper的重復(fù)reads范圍大(3-6%)(圖2)。對(duì)文庫(kù)分子插入量的檢查顯示，ThruPLEX DNA-Sea試劑盒產(chǎn)生的插入量為190 bp。大約相當(dāng)于KAPA Hyper庫(kù)，但比NEBNext Ultra的150-bp插入長(zhǎng)約27%(圖2)。在對(duì)配對(duì)端讀取時(shí)，插入長(zhǎng)度越長(zhǎng)往往越有利，因?yàn)橛懈嗟牟恢丿B讀取，可以更好地表示原始序列信息。

 圖2. 高度多樣化的庫(kù)。與其他測(cè)試試劑盒相比，ThruPLEX DNA-seq文庫(kù)提供了更多*的分子(上圖)和更少的重復(fù)(上圖)。下圖:ThruPLEX DNA-seq創(chuàng)建的分子平均插入尺寸比NEB Next Ultra長(zhǎng)-27%。比較了三種試劑盒制備的文庫(kù)的GC覆蓋率。ThruPLEX DNA-Seg試劑盒產(chǎn)生了平衡的GC覆蓋率(圖3)。

圖3. 均一的GC的覆蓋度。由ffpe衍生的DNA制成的DNA序列分析文庫(kù)覆蓋了整個(gè)人類基因組。然后使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板對(duì)ThruPLEX DNA-seg文庫(kù)進(jìn)行富集。在每種情況下，庫(kù)的質(zhì)量都很高，如圖4中的數(shù)據(jù)所示。通過測(cè)序深度測(cè)量的Kinome覆蓋率與樣本有關(guān)，并在目標(biāo)面板覆蓋40-50X的情況下進(jìn)行測(cè)序。所有樣品上餌覆蓋率均大于70%

圖4. 使用Agilent ClearSeq Human DNA Kinome面板豐富了ThruPLEX DNA-seq文庫(kù)的目標(biāo)測(cè)序指標(biāo)。

 結(jié)論                                                

FFPE樣本的序列可能非常具有挑戰(zhàn)性。在固定過程中引入的不同程度的化學(xué)損傷減少了可用于構(gòu)建文庫(kù)的“優(yōu)質(zhì)”材料的數(shù)量。為此，在這一系列實(shí)驗(yàn)中，我們修改了標(biāo)準(zhǔn)的ThruPLEX DNA seq協(xié)議，將輸入量增加到100ng。這使我們能夠創(chuàng)建更多樣化的庫(kù)(庫(kù)復(fù)雜性高80-240%)，并且比其他庫(kù)準(zhǔn)備試劑盒包含更少的擴(kuò)增。

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